1. Giới thiệu

• PCR (Polymerase Chain Reaction) là viết tắt của "phản ứng chuỗi polymerase". Đây là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại phân tử DNA hoặc đoạn phân tử RNA ngoài cơ thể sống nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA bằng cách nhân bản enzyme in vitro.

• Quá trình này được gọi là "phản ứng dây chuyền" vì mẫu DNA gốc được nhân đôi theo cấp số nhân trong mỗi chu kỳ. PCR được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử, vi sinh học, di truyền, chẩn đoán và phòng thí nghiệm lâm sàng, pháp y và môi trường, bên cạnh một số ứng dụng khác.

2. Thiết lập phòng xét nghiệm PCR

• Kỹ thuật PCR đã trở thành một phần không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm để khuếch đại một lượng nhỏ mẫu axit nucleic.

• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm lưu ý rằng PCR có nguy cơ nhiễm từ chính sản phẩm khuếch đại. Điều cần thiết là phải áp dụng các biện pháp phòng ngừa để đảm bảo không xảy ra nhiễm chéo giữa các mẫu, tránh kết quả dương tính giả.

2.1 Sắp xếp Bố Cục Không Gian Phòng Thí Nghiệm

• Gồm 2 khu vực chính: khu vực tiền khuếch đại và khu vực hậu khuếch đại, nằm ở các phòng riêng biệt với các trạm làm việc và tủ an toàn sinh học riêng biệt.

• Một phòng thí nghiệm PCR phân tích mẫu chẩn đoán thường được chia thành các khu vực sau:

• Khu vực chuẩn bị thuốc thử (sử dụng áp suất dương): Được chỉ định để chuẩn bị và bảo quản thuốc thử PCR. Bao gồm bàn làm việc sạch, tủ lạnh và tủ đông, pipet, ống nghiệm và giá đỡ, máy ly tâm, thiết bị bảo hộ cá nhân và hệ thống thông gió và lọc không khí để đảm bảo môi trường sạch.
• Khu vực chuẩn bị mẫu (sử dụng áp lực âm): Dùng để xử lý và chuẩn bị các mẫu. Bao gồm bàn làm việc sạch, tủ an toàn sinh học, pipet, ống nghiệm và giá đỡ, máy ly tâm, dung dịch đệm và thuốc thử, cùng với thiết bị bảo hộ cá nhân và hệ thống thông gió.
• Khuếch đại và phát hiện sản phẩm (sử dụng áp lực âm): Đây là nơi phản ứng PCR thực sự diễn ra, sử dụng các thiết bị đặc biệt để giữ sản phẩm khuếch đại trong phòng, ngăn ngừa ô nhiễm các khu vực khác.
• Khu vực phân tích kết quả: Nơi phân tích và lưu trữ kết quả xét nghiệm PCR.

=> Phải tuân thủ quy trình làm việc một chiều để giảm nguy cơ ô nhiễm. Không chuyển các vật liệu, dụng cụ từ phòng chuẩn bị mẫu vào phòng chuẩn bị thuốc thử, hoặc từ phòng khuếch đại vào các khu vực khác.

2.1.1. Phòng chuẩn bị thuốc thử: được chỉ định để chuẩn bị và bảo quản thuốc thử PCR

• Để ngăn ngừa ô nhiễm chéo và để tránh lặp lại đông lạnh và tan băng, giải pháp thuốc thử phải được chia thành nhiều khối lượng nhỏ hơn.

Thiết bị bao gồm:

• Bàn làm việc sạch: Nơi để chuẩn bị và pha chế các thuốc thử.
• Tủ lạnh và tủ đông: Dùng để bảo quản thuốc thử ở nhiệt độ thích hợp, ngăn ngừa hư hỏng.
• Pipet và pipetman: Các thiết bị cần thiết để đo lường chính xác lượng thuốc thử.
• Ống nghiệm và giá đỡ: Dùng để chứa và xử lý các mẫu và thuốc thử.
• Máy ly tâm: Để tách các thành phần khác nhau của mẫu.
• Thiết bị bảo hộ cá nhân: Găng tay, áo choàng, và kính bảo hộ để đảm bảo an toàn cho nhân viên.
• Hệ thống thông gió và lọc không khí: Để đảm bảo không khí trong khu vực này luôn sạch và không có các tạp chất gây nhiễm.

2.1.2. Phòng chuẩn bị mẫu: được chỉ định để xử lý mẫu

• Phòng này được sử dụng để tách axit nucleic với số lượng mẫu lâm sàng được yêu cầu sau đó chuyển sang khu vực chiết RNA/axit nucleic. Các mẫu đã được xử lý được thêm vào các ống chứa thuốc PCR gốc trong phòng này. Các ống PCR nên được hạn chế ngay sau khi mẫu được thêm vào.

Thiết bị bao gồm:

• Bàn làm việc sạch: Nơi để xử lý và chuẩn bị các mẫu cần phân tích.
• Tủ an toàn sinh học (Biosafety Cabinet): Bảo vệ mẫu khỏi nhiễm khuẩn và bảo vệ nhân viên khỏi các tác nhân gây bệnh.
• Pipet và pipetman: Dụng cụ đo lường và chuyển mẫu một cách chính xác.
• Ống nghiệm và giá đỡ: Dùng để chứa và phân loại các mẫu trong quá trình xử lý.
• Máy ly tâm: Thiết bị để tách các thành phần của mẫu nếu cần.
• Dung dịch đệm và thuốc thử: Các hóa chất cần thiết để xử lý mẫu.
• Hệ thống thông gió và lọc không khí: Đảm bảo không khí trong phòng sạch và không bị ô nhiễm.
• Thiết bị bảo hộ cá nhân: Găng tay, áo choàng, và kính bảo hộ để đảm bảo an toàn cho nhân viên.

2.1.3 Phòng khuếch đại và phòng sản phẩm khuếch đại: được chỉ định để khuếch đại PCR và phân tích sau PCR

• Phòng này nên được giữ ở áp lực âm. Mặc dù khuếch đại PCR và phân tích sau PCR có thể được thực hiện trong cùng một phòng, việc phân tách thành các khu vực hoặc phòng riêng biệt sẽ giúp giảm nguy cơ ô nhiễm từ các sản phẩm khuếch đại.

Các dụng cụ bao gồm:

• Máy PCR (Thermal Cycler), máy chu trình nhiệt/Real-time PCR: Thiết bị chính để thực hiện phản ứng khuếch đại DNA.
• Ống nghiệm và giá đỡ: Dùng để chứa các mẫu trong suốt quá trình khuếch đại.
• Pipet và pipetman: Được sử dụng để phân chia chính xác lượng mẫu và thuốc thử.
• Tủ giữ nhiệt: Dùng để bảo quản thuốc thử và mẫu ở nhiệt độ cần thiết.
• Thiết bị bảo hộ cá nhân: Găng tay, áo choàng, và kính bảo hộ để đảm bảo an toàn cho nhân viên.
• Hệ thống lọc không khí: Đảm bảo không khí trong phòng luôn sạch và ngăn ngừa ô nhiễm.

2.2 Chăm sóc và bảo trì phòng máy PCR

2.2.1 An toàn điện:

• An toàn về điện là ưu tiên hàng đầu khi sử dụng bất kỳ thiết bị điện trong phòng thí nghiệm máy PCR.
• Không mở nắp/cửa của dụng cụ trong khi máy đang hoạt động.
• Phích cắm và ổ điện cần được kiểm tra định kỳ bởi kỹ thuật viên để đảm bảo tính nguyên vẹn và chất lượng của nguồn điện (điện thế, đường nối,…).
• Chọn và sử dụng các thiết bị điện có tích hợp các biện pháp an toàn như ngắn mạch và bảo vệ khỏi dây dẫn bị nhiễm.
• Kiểm tra định kỳ các thiết bị và thay thế khi phát hiện hư hỏng.

2.2.2 An toàn hóa chất:

• Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân: Găng tay, kính bảo hộ, và áo choàng khi làm việc với hóa chất.
• Cung cấp thông tin an toàn hóa chất (MSDS): Mỗi hóa chất nên đi kèm với Bảng Dữ Liệu An Toàn Hóa Chất để nhân viên có thể tra cứu khi cần.
• Đào tạo nhân viên: Đảm bảo rằng tất cả nhân viên đều được đào tạo về an toàn hóa chất và cách xử lý các tình huống khẩn cấp, trang bị các biện pháp phòng ngừa thích hợp.
• Lưu trữ hóa chất đúng cách: Hóa chất nên được lưu trữ trong các thùng chứa phù hợp và được dán nhãn rõ ràng.

2.2.3 Máy sạch:

• Giữ môi trường không bụi để bảo vệ các vi mạch và phần quang học của máy PCR.
• Vệ sinh sau mỗi lần sử dụng: Lau chùi máy móc và bề mặt làm việc bằng dung dịch khử trùng.
• Kiểm tra định kỳ: Thực hiện kiểm tra định kỳ để phát hiện và khắc phục kịp thời các vấn đề.
• Kiểm tra giếng: Làm sạch giếng trong khối PCR hoặc sử dụng chồi tai cho mỗi giếng.

2.2.4 Xác định nhiệt độ:

• Sử dụng nhiệt kế chính xác: Sử dụng nhiệt kế điện tử hoặc nhiệt kế thủy ngân để đo nhiệt độ môi trường.
• Giám sát liên tục: Hệ thống giám sát nhiệt độ có thể ghi lại và báo cáo bất kỳ sự thay đổi nào.
• Hiệu chuẩn định kỳ: Thực hiện hiệu chuẩn thiết bị đo nhiệt độ thường xuyên.
• Điều hòa nhiệt độ: Sử dụng máy điều hòa để duy trì nhiệt độ ổn định trong phòng thí nghiệm.
• Hệ thống báo động: Cài đặt hệ thống báo động để thông báo khi nhiệt độ vượt ngưỡng an toàn.

2.2.5 Kiểm tra và hiệu chuẩn huỳnh quang:

• Dụng cụ real-time PCR được trang bị để thực hiện kích thích và phát hiện huỳnh quang nhằm theo dõi sự khuếch đại trong suốt chu trình PCR.
• Kiểm tra độ phân giải: Sử dụng các mẫu huỳnh quang có độ sáng khác nhau để kiểm tra khả năng phân giải của hệ thống.
• Kiểm tra độ chính xác: Sử dụng các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết để đo lường và xác định độ chính xác của hệ thống.
• Kiểm tra độ nhạy: Đảm bảo rằng hệ thống có độ nhạy cao để phát hiện những thay đổi nhỏ trong mẫu.
• Kiểm tra độ ổn định: Sử dụng mẫu không chứa huỳnh quang để kiểm tra tính ổn định của hệ thống trong thời gian dài.
• Hiệu chuẩn định kỳ: Thực hiện hiệu chuẩn định kỳ để đảm bảo hệ thống luôn hoạt động chính xác và ổn định.